大家好，今天来介绍hisat2比对需要多久(hisat2建立索引需要多久)的问题，以下是渲大师小编对此问题的归纳和整理，感兴趣的来一起看看吧！

小麦RNAseq利用hisat2构建index过程

根据崔女神文章 https://www.jianshu.com/p/071c1757ded1
利用hisat2来构建小麦的转录组的索引文件，服务器内存64G，构建的命令如下：

构建过程中提示提示内存不足，但是可自动优化参数，构建时间全长大约为3个拍宽小时。

IWGSC.1.ht2l 16M
IWGSC.2.ht2l 4B（你没有看错，是4B）
IWGSC.3.ht2l 12M
IWGSC.4.ht2l 3.4G
IWGSC.7.ht2l 25M
IWGSC.8.ht2l 3.7M

但是rf文件还不确定有何用，经研究和设置的线程数有关，8个线程即生成8个rf文件，20个线程即生成20个rf文件。

至此，小麦RNA-seq索引文件构建完毕，本人连续3次构建了小麦的袭森亮index文件，文件大小略有不同，下一步测试比对index是否可用，同时测试run out of memory是否对索引文件构建的成功与否有影响，感谢崔老春裂师。

HISAT2 建立索引警告和比对时报错解决方案

tags： HISAT2 RNA-seq

HISAT2 发表的文章中强调了它的速度很快，我就测试了一下这个工具。

HISAT2 建立索引：

然而没多久就看到这样的警告：

只是警告，并没有报错。

HISAT2 建参考索引很慢，等 HISAT2 建完索引（建索引花了 16 个小时），然后用 HISAT2 比对 RNA-seq 数据测试。

几分钟之后报错了：

github 上有人在 HISAT2 项目中报告过这个错误，虽然没有最终讨论出解决办法，但是都觉得跟建索引不完整有关，或许与建索引时候的警告有关。我查了一些资料，综合 biostar 和 SEQanswer 中的讨论，建立索引时遇到的警告是由于参考序列中存在大段的 n 碱基导致的，例如其中一条 fasta 中 n （我遇到的是小写的 n）太多。解决办法也很简单，过滤掉参考序列中长度小于 50bp 的 contig 和序列中连续 n 碱基超过 40bp 的contig 。然后重新建索引，就没有任何警告了，但是会损失部分参考序列。这样处理之后建的索引再睁唤庆用 HISAT2 比对 RNA-seq 数据，就没有问题了。

HISAT2 比对速度确实很快，一个样本转录组数据比对 2G 的核糖体 RNA 参考基因组约 25 分钟，bowtie2 需要 170 分钟（线程数都是 4）。 bowtie2 的 local 模式比对出 21% 的 rRNA 污染链宴，而 HISAT2 比对 2% 的 rRNA 污染，差异也挺大的……

但是，HISAT2 的线程数不能设置太高，用户手册中建议对人类参考基因组进行比对时，线程数设置在 1-8 之间。我用文献悉握 Transcript-level expression analysis of RNA-seq
experiments with HISAT, StringTie and Ballgown 中的数据测试也发现当线程数超过 12 时整个比对步骤消耗的时间反而会增加。

真核生物mRNA测序

一、真核生物mRNA的结构：

二、建库方式：
真核生物mRNA含有poly-A尾，因此最常用的富集真核生物mRNA的方法就是采用附着poly-T oligo的磁珠从total RNA 中抓取mRNA。建库示意图如下图所示：
1、提取总RNA：提取总RNA后需要对其进行质量检查，包括纯度、浓度和完整性（RIN）。如果总RNA起始量太低，不能保证有足够的mRNA用于建库。另外RNA容易降解，而采用附着poly-T oligo的磁珠捕获降解后的RNA会产生3’偏好性，因此建议RIN值大于等于7。
2、mRNA捕获：真核生物的成熟mRNA带有poly-A尾，因此可以采用附着poly-T oligo的磁珠从总铅虚漏RNA中捕获mRNA。
3、mRNA片段化：
4、cDNA第一链合成：以mRNA为模板合成cDNA。
5、cDNA第二链合成：以cDNA第一链为模板合成cDNA第二链。
6、双链cDNA末端修复：3’槐烂加A，5’修复。
7、加接头：
8、PCR富集mRNA文库。
9、上机测序。

三、生信分析：
1、数据拆分：利用bcl2fastq软件将bcl文件转换成fastq文件。
2、数据预处理：有些测序reads可能包含测序接头、引物序列、低质量碱基、N含量较高，因此通常需要对测序数据进行预处理，去除这些不合格的碱基或reads。常用的软件有fastp，cutadpater以及Trimmonmatic等。
3、质控分析：对预处理后的数据进行质控分析，通常采用fastqc。
4、参考基因誉高组比对：将测序数据与参考基因组进行比对，常用的比对软件有hisat2，tophat2，STAR等。
5、转录本的组装和定量：常用的软件有cufflinks，stringtie等。
6、差异分析：分析不同处理条件下基因或转录本的表达是否有差异，穿能够与的软件有DEseq2，edger，ballgown等。
7、富集分析：对差异基因进行富集分析，统计学原理是基于超几何分布。

有参转录组分析

• 总体上来说HISAT利用了BWA和Bowtie的算法，同时解决了mRNA中不存在内含子难以比对的问题，比对上代主流RNA-seq比对工具能快50倍，同时需求更少的内存<8G（这就意味着你可以在PC上跑数据），20个样本，每个样本一亿reads的估计，用一台电脑一天之内能够跑完。使用者可以提供精确的基因注释来提高在已知基因区域的准确性，但这是可选项。

• Transcript assembly and quantification with StringTie

• RNA-seq的分析依赖于精准的对于基因isoform的重建以及对于基因相对丰度的预测。继承于Cufflinks，StringTie相对于之前开发的工具更为准确，需求内存和耗时也更少。

• 使用者一样可以乱猛盯使用注释文件来帮助StringTie运行，对于低丰度的数据比较有帮助。此时StringTie依旧会对非注释区域进行转录本的组装，所以注释文件在这里是可选选项。

首先添加环境变量，如果使用conda的话需要 source activate

hisat2支持对gtf文件构建索引，并且可以向其中添加外显子，SNP等信息，进一步完善索引

随后利用 ballgown 或者 featurecount 得到表达矩阵进行下游分析

对于可变剪切一般使用 rMATs 进行统计，rMATS是一款对RNA-Seq数据进行差异可变剪切分析的软件。其通过rMATS统计哗和模型对不同样本（有生物知困学重复的）进行可变剪切事件的表达定量，然后以likelihood-ratio test计算P value来表示两组样品在IncLevel（Inclusion Level）水平上的差异(从公式上来看，IncLevel跟PSI的定义也是类似的)，lncLevel并利用Benjamini Hochberg算法对p value进行校正得FDR值。rMATS可识别的可变剪切事件有5种，分别是skipped exon (SE)外显子跳跃，alternative 5′ splice site (A5SS)第一个外显子可变剪切，alternative 3′ splice site (A3SS)最后一个外显子可变剪切，mutually exclusive exons (MXE)外显子选择性跳跃和 retained intron (RI)内含子滞留

随后对结果进行可视化，

SAM/BAM相关的进阶知识

目录

samtools 和 picard 都有对SAM/BAM文件进行排序的功能，一般都是基于坐标排序（还提供了 -n 选项来设定用reads名进行排序），先是对chromosome/contig进行排序，再在chromosome/contig内部基于start site从小到大排序，对start site排序很好理解，可是对chromosome/contig排序的时候是基于什么标准呢？

基于你提供的 ref.fa 文件中的chromosome/contig的顺序 。当你使用比对工具将fastq文件中的reads比对上参考基因组后会生成SAM文件，SAM文件包含头信息，其中有以 @SQ 开头的头信息记录，reference中有多少条chromosome/contig就会有多少条这样的记录，而且它们的顺序与 ref.fa 是一致的。

当使用samtools或picard对SAM/BAM文件进行排序时，这些工具就会读取头信息，按照头信息指定的顺序来排chromosome/contig。所以进行排序时需要提供包含头信息的SAM/BAM文件。

那么 普通情况下我们的chromosome/contig排序情况是什么样的?

一般情况下在进行SAM文件的排序时，染色体的排序到底是按照哪种规则进行排序的，不是一个很重要的问题，也不会对后续的分析产生影响，但是在执行GATK流程时，GATK对染色体的排序是有要樱陆求的，必须按照从chr1开始到chr22，最后是chrX和chrY这样的顺序，否则会报错

面对这样变态的要求，我们怎么解决？

在构造ref.fa文件时，让它按照从chr1开始到chr22，最后是chrX和chrY这样的顺序进行组织就可以了：

FLAG列在SAM文件的第二列，这是一个很重要的列，包含了很多mapping过程中的有用信息，但很多初学者在学习SAM文件格式的介绍时，遇到FLAG列的说明，常常会一头雾水

what?还二进制，这也太反人类的设计了吧！

不过如果你站在开发者的角度去思考这个问题，就会豁然开朗

在mapping过程中，我们想记录一条read的mapping的信息包括：

这些信息总结起来总共包括以下12项：

而每一项又只有两种情况，是或否，那么我可以用一个12位的二进制数来记录所有的信息，每一位表示某一项的情况，这就是原始FLAG信息的由来，但是二进制数适合给计算机看，不适合人看，需要转换成对应的十进制数，也就有了我们在SAM文件中看到的FLAG值

但是FLAG值所包含信息的解读还是要转换为12位的二进制数

SAM格式文件的第3和第7列，可以用来判断某条reads是否比对成功到了基因组的染色体，左右两条reads是否比对到同一条染色体

有两个方法可以提取未比对成功的测序数据：

对于PE数据，在未比对成功的测序数据可以分成3类：

看完这一部分，是不是有一个感觉： FLAG玩得溜局颂睁，SAM文件可以处理得出神入化

首先，思考一个问题： 对于PE数据，一条测序片段（fragment）有read1和read2两条测序片段，它们俩的名字相同，那么对于这一条测序片段，对它进行mapping之后得到的SAM文件中会出现几条记录呢？

对于我的这个假设可以用以下的方法进行验桐岁证：

上面的测试结果与我们的假设吻合

但是在一次处理三代测序数据（三代测序数据是Single-End）中发现了不同：

在输出中出现了一些不太和谐的结果：有极少部分的QNAME对应2条以上的记录，这意味着存在一条read会有多条比对记录的情况，why？

对这个与预期不完全相符的结果，尝试去寻找里面的原因，其间进行了各种各样的推理、假设、验证，最终在 李恒的github 中找到了答案

这种情况容易在三代测序数据中出现

如果你用的是Single-End的数据，那么差异应该比较小，不会太明显，而在Pair-End上差异可能会比较大，之所以会产生这些差异，原因有两点：

从上面列出的两点差异可以看出，mpileup默认输出的是高质量的覆盖深度，这是有历史原因的：当场mpileup功能被开发出来就是为了与bcftools组合，将samtools mpileup的输出作为bcftools的输入用于下游的snp-calling，当然需要保证数据的质量

当然可以通过设置对应的参数使得它的属于结果与depth的一致，但是不推荐这么做

下面是对同一个样本的paired-end Fastaq文件比对结果（比对使用hisat2），hisat2和samtools分别给出的mapping rate的统计

hisat2：

samtools flagstat：

从上面可以看出，hisat2给出的mapping rate为85.40%，而samtools给出的为86.32%，两个的统计结果不一样，而且samtools的统计会大一些，what？

介四什么鬼？

我们来简单地分析一下：

hisat2中，

samtools中，

计算没问题，那问题出在哪呢？

有没有注意到上面的两个式子中的分子和分母，计算它们的差值：

分子：

分母：

发现了没有，它们的差值正好都等于samtools flagstat的输出结果的第二行：

所以，hisat2和samtools计算mapping rate的公式实际上分别为：

一般来说，我们想得到的是hisat2计算公式所得到的统计结果，hisat2统计结果在比对结束后会以标准错误形式给出，我们可以将标准错误重定向到一个log文件中，但是如果我们忘了保持这个统计结果，怎么办？

最简单的办法就是重新跑一遍hisat2，但是这样太耗费时间和计算资源了，这时我们可以利用samtools flagstat对SAM文件的统计结果，以及它的部分统计值与hisat2计算公式的关系，快速地算出准确的mapping rate：

(1) 【】从零开始完整学习全基因组测序数据分析：第5节 理解并操作BAM文件

(2) 【生信技能树】【直播】我的基因组（十五）:提取未比对的测序数据

(3) BWA’s README in github

(4) 【】黄树嘉《样本量重要，还是测序深度重要? 生物信息工程师可以分为多少种类型? 《解螺旋技术交流圈》精华第3期》

(5) 生信媛《HISAT2的比对率计算结果和SAMTools flagstat不同，你想过原因吗？ 》