源自微生物群的醋酸盐能够在健康和疾病期间促进大脑先天免疫系统的代谢适应性

Microbiota-derived acetate enables the metabolic fitness of the brain innate immune system during health and disease

Cell Metabolism [IF: 27.287]

DOI：https://doi.org/10.1016/j.cmet.2021.10.010

发表日期：2021-11-02

第一作者：Daniel Erny^1,2,12,Nikolaos Dokalis^1,3,12,Charlotte Mezo^1,3,12

通讯作者：Marco Prinz(marco.prinz@uniklinik-freiburg.de)^1,9,10,13

合作作者：Angela Castoldi,Omar Mossad,Ori Staszewski,Maximilian Frosch,Matteo Villa,Vidmante Fuchs,Arun Mayer,Jana Neuber,Janika Sosat,Stefan Tholen,Oliver Schilling,Andreas Vlachos,Thomas Blank, Mercedes Gomez de Aguero,Andrew J. Macpherson,Edward J. Pearce

主要单位：

^1,2,3,9,10德国弗莱堡大学(Institute of Neuropathology, University of Freiburg, Freiburg, Germany;Berta-Ottenstein-Programme, Faculty of Medicine, University of Freiburg, Freiburg, Germany;Faculty of Biology, University of Freiburg, Freiburg, Germany;Center for Basics in NeuroModulation (NeuroModulBasics), Faculty of Medicine, University of Freiburg, Freiburg, Germany;Signalling Research Centres BIOSS and CIBSS, University of Freiburg, Freiburg, Germany)

图文摘要

醋酸盐是关键的微生物组衍生的短链脂肪酸(SCFA)，可驱动小胶质细胞成熟并调节体内平衡代谢状态。此外，醋酸盐在阿尔茨海默病小鼠模型中调节小胶质细胞对淀粉样蛋白 β 的吞噬作用和疾病进展。无菌 GF(+醋酸盐)和 SPF 5xFAD 模型

亮点

在没有宿主微生物群的情况下改变小胶质细胞的代谢特征
细菌来源的醋酸盐在稳态期间调节小胶质细胞的代谢特征
醋酸盐在神经变性过程中调节小胶质细胞的功能

总结

小胶质细胞作为中枢神经系统(CNS)的组织巨噬细胞，构成该器官的中枢免疫细胞。小胶质细胞的特征强烈依赖于环境线索，如共生微生物群。已知肠道细菌通过产生短链脂肪酸(SCFAs)持续调节小胶质细胞的成熟和功能。然而，这种串扰的确切机理尚不清楚。在此，我们确定了无菌(GF)小鼠小胶质细胞的不成熟表型是由H3K4me3和H3K9ac表观遗传印记在与实质性功能改变(包括线粒体质量增加和特异性呼吸链功能障碍)相关的代谢基因上的。我们将醋酸盐确定为驱动小胶质细胞成熟和调节稳态代谢状态的必需微生物源性SCFA因子，并进一步表明其能够在神经变性期间调节小胶质细胞吞噬作用和疾病进展。这些发现表明，在健康和扰动期间，醋酸盐是驱动小胶质细胞代谢途径和功能的必需细菌衍生分子。

背景

小胶质细胞是中枢神经系统(CNS)中的主要巨噬细胞群，在几乎所有CNS疾病(从神经炎症、神经退行性和神经肿瘤疾病到神经发育性精神病)的发病机制中起关键作用。小胶质细胞寿命长，对各种信号的反应具有可塑性。通过塑造其他胶质细胞和神经元，他们被认为是中枢神经系统发育和稳态的重要调节因子。

已知集落刺激因子(colony-stimulating factor, CSF)1和白细胞介素(IL)-34等组织特异性因子以及环境因子控制CNS中的小胶质细胞身份。此前，我们发现肠道细菌在稳态条件下和扰动后维持小胶质细胞的成熟和功能。例如，在无菌(GF)条件下饲养的小鼠缺乏所有共生细菌，表现出不成熟的小胶质细胞表型，细胞数量不规则，形态改变，抗病毒功能减弱。我们发现，微生物群来源的细菌发酵产物短链脂肪酸(SCFAs)能够使未成熟小胶质细胞表型正常化。在帕金森病(PD)模型中，SCFAs也被证明可加速疾病进展。在阿尔茨海默病(AD)小鼠模型中，宿主微生物群的缺失导致淀粉样β(aβ)负荷减少，这表明肠道细菌可能通过加速小胶质细胞衰竭而加重AD和PD。相比之下，在多发性硬化(MS)期间，SCFAs(特别是丙酸盐)已显示出具有保护作用，因为它们能够调节循环调节性T细胞中的线粒体功能，从而改善调节功能并调节疾病发展。肠道和中枢神经系统的功能联系在所谓的肠-脑轴中概念化。

一般来说，众所周知，许多免疫反应都伴随着细胞代谢的显著变化。例如，T细胞利用多种代谢途径实现分化和激活。然而，对于小胶质细胞，大多数针对细胞代谢的研究采用了体外永生化细胞系或原代小胶质细胞和骨髓巨噬细胞培养物及其伴随的问题，因此关于体内小胶质细胞代谢变化的见解很少。此外，驱动免疫调节的细菌衍生产物的确切性质和所涉及的确切细胞途径尚未探索。

因此，我们试图破译在体内平衡期间哪些小胶质细胞的功能受到宿主微生物群的影响。我们确定GF小鼠小胶质细胞中代谢基因表达的改变是表观遗传印记的。随后，我们分析了GF小鼠离体小胶质细胞的代谢状态，确定了导致这些细胞功能损伤的线粒体变化和相关功能障碍。此外，我们在体内追踪肠源性醋酸盐，并检测到稳态期间GF小鼠小胶质细胞代谢缺陷的醋酸盐依赖性适应。我们最终确定，醋酸盐通过其抑制小胶质细胞吞噬的能力，对神经变性过程具有调节作用。

结果

在没有共生细菌的情况下，代谢性小胶质细胞基因的H3K4me3和H3K9ac增强

Acetate regulates microglial functions during
neurodegeneration

为了分析GF小鼠小胶质细胞中的潜在转录变化，我们首先进行了大规模RNA测序(RNA-seq)(图1A)，并证实了我们之前的发现。与无特定病原体(SPF)对照相比，我们在GF小鼠的小胶质细胞中观察到256个上调和下调转录物的显著转录变化。差异表达最多的基因(DEGs)包括增殖相关基因DNA损伤诱导转录物4 (DNA damage inducible transcript 4，Ddit4，与SPF相比，GF小鼠小胶质细胞增加4.04 log2倍)和小胶质细胞活化基因载脂蛋白E (apolipoprotein E，Apoe，与SPF相比，GF小鼠小胶质细胞增加1.28 log2倍)。相反，在GF小胶质细胞中，Il1a和Ly86(编码MD-1)的mRNA显著减少。

图1 | 宿主微生物群的缺失会改变代谢相关基因的全基因组小胶质细胞甲基化和乙酰化概况

Acetate regulates microglial functions during
neurodegeneration

(A) RNA-seq分析，显示雌性SPF或GF动物的小胶质细胞中差异表达的基因(DEGs)，经调整后p < 0.05。颜色代码显示Z分数(红色，上调；蓝色，下调)；

(B,C) 基于RNA-seq分析的雌性SPF或GF小鼠小胶质细胞中DEGs的独创性通路分析(IPA)。-log(p)和预测的活化Z评分(红色，活性增加；蓝色，活性降低；灰色，没有可用的预测Z分数)；

(D) 以转录开始侧(TSS)为中心的3 kb内来自SPF或GF小鼠的小胶质细胞的H3K4me3(左，蓝色)或H3K9ac(右，红色)分布图。对每组4只SPF和GF雌性小鼠的小胶质细胞进行了一项实验；

(E) 雌性SPF或GF小鼠小胶质细胞的H3K4me3(上图)或H3K9ac(下图)分布图；

(F–I) IPA显示，与SPF对照相比，在雌性GF动物的小胶质细胞中，启动子中H3K4me3或H3K9ac发生改变的基因的功能(F和G)和典型(H和I)途径发生了显著改变。-log(p)和预测的活化Z评分(红色，活性增加；蓝色，活性降低；灰色，没有可用的预测Z分数)；

(J) 通过qRT-PCR在SPF和GF小鼠(混合性别)的小胶质细胞中测定Ddit4 mRNA。基因表达恢复正常，为β-Actin。数据代表了三个独立的实验；

(K) ChIP-seq数据，显示来自雌性SPF和GF小鼠小胶质细胞的Ddit4启动子区域中的H3K4me3的覆盖率。RPKM值显示在y轴上。显示了一个实验中4个单独样本的平均值。

为了获得对受微生物群缺陷影响的小胶质细胞功能和典型通路的机理见解，我们进行了独创性途径分析(ingenuity pathway analysis，IPA)(图1B和1C)。注释的功能“免疫细胞增殖”(上)、“细胞存活”(上)、“巨噬细胞发育”(下)和“细胞因子数量”(下)或注释的通路“STAT3通路”(下)或“神经炎症信号通路”(下)发生显著变化，支持GF动物中的小胶质细胞不成熟的观点。值得注意的是，与代谢相关的术语，如降低的“脂质浓度，线粒体数量”和“巨噬细胞中ROS的产生”，在GF小胶质细胞中也是不同的(图1B和1C)。

之前有描述称，宿主微生物群会影响小胶质细胞中开放的染色质边（open chromatin sides）。为了研究宿主微生物群的缺失是否改变，特别是组蛋白甲基化或特定基因的乙酰化，我们接下来分别通过H3K4me3和H3K9ac的染色质免疫沉淀测序(ChIP-seq)进行了全基因组表观遗传学分析(图1D-1I)。尽管与SPF对照相比，H3K4me3的全局水平仅显示GF小鼠的小胶质细胞有细微变化，但详细分析发现239个基因的近端启动子处H3K4me3的丰度升高。相反，在GF小鼠的小胶质细胞中发现613个基因的活性启动子处H3K9ac水平升高。

接下来，我们根据其分子功能对H3K4me3和H3K9ac水平改变的基因进行了分类(图1F和1G)和典型通路(图1H和1I)。与RNA-seq分析中明显的类别相似的类别也出现在ChIP-seq分析中，包括H3K4me3的“细胞成熟减少和细胞数量增加”以及H3K9ac的“细胞周期进程增加”和“线粒体密度”(图1B、1C和1F-1I)。值得注意的是，由RNA-seq揭示的Ddit4在GF小鼠小胶质细胞中的表达增加(图1A)，qRT-PCR证实了这一结果(图1J)，与转录激活相关的SPF小胶质细胞相比，在GF小胶质细胞的近端启动子中H3K4me3的丰度也更高(图1K)。此外，蛋白质组分析显示，从SPF和GF小鼠中分离的小胶质细胞具有相似的功能和典型途径类别。

总之，这些数据表明，宿主微生物群的终身缺失会导致基因表达的变化以及相关的组蛋白乙酰化和甲基化标记的表观遗传学变化，这些变化发生在基因的特定启动子区域，不仅控制小胶质细胞的增殖、形态和活化，还控制代谢功能，包括线粒体密度。

在没有宿主微生物群的情况下，小胶质细胞代谢特征发生变化

Acetate regulates microglial functions during
neurodegeneration

接下来，我们重点讨论了线粒体代谢功能可能受到宿主微生物群影响的可能性。我们对来自SPF和GF小鼠的离体荧光激活细胞分选(fluorescence-activated cell sorting，FACS)-分离小胶质细胞进行了全面的代谢产物分析，共检测到759种代谢产物。其中597个可以计算出与已知注释匹配的有效公式(formulas)，而162个被归类为未知。统计分析确定了107种推定的代谢产物，SPF和GF小胶质细胞之间存在显著差异(p < 0.05)，这些代谢产物的主成分分析(PCA)显示两组之间存在明显分离(图2A)。在这些代谢产物中，与SPF小胶质细胞相比，GF小鼠的小胶质细胞丰度有72种增加，35种减少(图2B)。一般来说，我们注意到氨基酸和肽的一些变化，表明氨基酸代谢异常。瓜氨酸、磷酸肌酸、精氨酸琥珀酸和鸟苷酸水平的变化表明精氨酸和脯氨酸代谢紊乱。此外，肌苷、肌苷酸和次黄嘌呤水平的改变表明GF小鼠小胶质细胞中嘌呤代谢紊乱。与SPF小胶质细胞相比，GF小鼠的小胶质细胞中大量脂质和脂肪酸如[FA-氨基(8:0)]3-氨基-辛酸被耗竭。

图2 | 共生微生物的缺乏会改变小胶质细胞的代谢特征

Acetate regulates microglial functions during
neurodegeneration

(A) 六份SPF和六份GF小胶质细胞样本中出现显著改变的代谢产物的PC1和2主成分分析(PCA)图。对雌性小鼠进行了一项实验；

(B) SPF(左)和GF(右)组之间来自非靶向代谢产物分析的显著改变的代谢产物的热图。色标表示缩放的强度:强度> 0为上调(红色)；强度< 0被下调(蓝色)；

(C) 来自SPF和GF小胶质细胞非靶向代谢产物分析的检测到的代谢产物的倍数变化图。色标表示log2倍变化的程度(红色，上调> 0.5；紫色，下调< 0.5)；

(D) 根据靶向和非靶向代谢产物分析，与SPF小胶质细胞相比，GF小胶质细胞中发生显著变化的代谢产物的通路匹配（Pathway matches of significantly changed metabolites in GF microglia compared to SPF microglia based on targeted and non-targeted metabolite profiling）。圆圈大小反映了路径影响，颜色代码可视化了log(p)值(白色= 0，黄色= 1，橙色= 2，红色> 3)。

为了更详细地探索小胶质细胞的中枢代谢途径，我们随后对62种代谢产物进行了靶向分析，其中42种可在来自SPF和GF小鼠的小胶质细胞中测定(图2C)。SPF和GF小胶质细胞之间的七种代谢产物存在显著差异。其中之一是核酮糖5-磷酸（ribulose 5-phosphate），其在GF小胶质细胞中增加，提示嘌呤代谢增加和核苷酸产生增加，这与之前描述的GF小鼠中小胶质细胞密度和增殖的升高广泛相关。此外，发现来自三羧酸(TCA)循环的代谢产物(如2-酮戊二酸(上调)和苹果酸(下调))对GF小胶质细胞有显著影响，而柠檬酸盐有减少的趋势。草酰乙酸(OAA)通过趋势在GF小鼠的小胶质细胞中累积，而GF小胶质细胞显示三磷酸腺苷(ATP)水平有趋势性降低。

总之，这些数据表明，TCA循环和嘌呤代谢的要素，以及小胶质细胞中的其他代谢途径，都受到宿主微生物群存在的影响(图2D)。

宿主微生物群在体内平衡过程中控制呼吸链复合体II的功能

Acetate regulates microglial functions during
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我们的数据表明，GF小鼠的小胶质细胞中线粒体代谢受到干扰。为了更详细地解决这个问题，我们接下来对该细胞区室进行了全面的功能分析。首先，我们使用细胞外流量分析(extracellular flux analysis)对离体分离自SPF和GF小鼠的小胶质细胞进行线粒体应激试验。令人惊讶的是，我们仅观察到细胞之间氧消耗率的微小差异。值得注意的是，来自SPF和GF小鼠的小胶质细胞均不具有任何备用呼吸能力(spare respiratory capacity, SRC)。通过与腹膜巨噬细胞的比较证实了这一点，其中与3 × 10^5小胶质细胞相比，仅1.5 × 10^5板层腹膜巨噬细胞具有显著更高的基础和最大呼吸及SRC，这表明在此实验环境中，与其他巨噬细胞相比，离体分离的小胶质细胞表现出相对较低的代谢周转，海马法可能对评估离体分离的小胶质细胞的代谢特征不够敏感。此外，我们还研究了细胞外酸化率(extracellular acidification rates，ECAR)，这是一种衡量糖酵解产生乳酸的指标，在SPF和GF小鼠的小胶质细胞之间相似，葡萄糖摄取也相似，而小胶质细胞的ECAR测量结果显示其水平与腹腔巨噬细胞相当。

随后，我们应用了基于流式细胞术的方法，灵敏度更高。首先，与SPF小鼠相比，我们观察到GF小鼠的Dump-CD11b+cd45小胶质细胞更大、颗粒更大(图3A)。细胞内粒度升高可能是由于溶酶体、脂滴和线粒体等细胞器丰度增加。然而，我们观察到GF小胶质细胞中脂质减少(通过Bodipy测量)(图3B)，这与代谢产物分析揭示的几种脂肪酸中观察到的变化一致(图2B)。此外，溶酶体追踪染色和CD68表达测定显示，GF状态对溶酶体室无影响。然而，通过有丝分裂跟踪器绿色染色测得，GF小鼠的小胶质细胞线粒体含量显著增加(图3C)。这些线粒体与SPF小胶质细胞的不同之处在于，它们的线粒体膜电位(δψm)降低，这是通过四甲基罗丹明甲酯(TMRM)染色测量的(图3D)。我们还注意到，在GF和SPF小鼠的小胶质细胞中，细胞活性氧(ROS) (CellRox)总量(图3E)和线粒体ROS(丝裂霉素)阳性小胶质细胞百分比(图3F)基本相似。与SPF对照组相比，GF小胶质细胞产生的线粒体ROS明显更多(图3F)。总之，这些观察到的线粒体质量、δψm和线粒体ROS的变化支持了线粒体生物学在GF小胶质细胞中受到显著影响的观点。

图3 | GF小鼠小胶质细胞线粒体功能减弱

Acetate regulates microglial functions during
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(A–F) 代表性流式细胞术图，显示(A)小胶质细胞大小(FSC，前向散射，左)和粒度(侧散射，SSC，右)，(B)脂质(Bodipy)，(C)线粒体质量(有丝分裂跟踪器绿)，(D)线粒体膜电位δψm(四甲基罗丹明甲酯，TMRM)，(E)雄性GF(红线)和SFP小鼠的CD11b+CD45low小胶质细胞上的总ROS (CellRox)和(F)线粒体ROS(有丝分裂Sox)(黑线)以及相应的对照(灰线)。此外，还描述了平均荧光强度(MFI)的定量以及有丝分裂Sox+细胞和的百分比。数据代表了三个独立的实验；

(G,H) 成年SPF和GF雄性小鼠皮质中小胶质细胞(G)的透射电子显微镜(TEM)图像，胞质中带有线粒体(红色箭头)并对其进行了定量(H)；

(I) 通过流式细胞术随时间测量的氧化磷酸化(任意单位，a.u .)。雄性SPF(左)和GF小鼠(右)的小胶质细胞δψm(由鱼藤酮(Rot)、琥珀酸盐(suc)和抗霉素A1 (AA1)操纵)的代表性流式细胞术图。数据代表了三个独立的实验；

(J) δψm的量化。数据代表三个独立实验；

(K–M) 显示了从雄性GF和SFP小鼠离体分离的小胶质细胞衍生的线粒体琥珀酸脱氢酶(SDHA) 和 电压依赖性阴离子选择性通道(VDAC) 的代表性免疫印迹(K)。将定量结果归一化为(L) β-ACTIN或(M) VDAC。数据代表了两个独立的实验；

(N) 定量FACS分离的小胶质细胞中的草酰乙酸(OAA)。将来自6个大脑的小胶质细胞混合到一个样本中；

(O,P) 通过流式细胞术从雄性SPF小鼠的小胶质细胞分析了OAA对复合物II的抑制作用。(O)δψm的代表性流式细胞术图及其(P)标准化量化(n = 3)。数据代表了两个独立的实验；

(Q) GF雄性小鼠皮层代表性Iba1⁺免疫组织化学染色并重新染色。GF小鼠；

(R) 定量。比例尺，50 μm。数据代表两个独立实验；

(S,T) 显示来自雄性GF(红线)的小胶质细胞上的(S)小胶质细胞线粒体质量和(T)δψm的代表性流式细胞术图，并重新着色。GF小鼠(黑线)和各自的对照(灰线)。此外，还描述了小额金融机构的量化。数据代表了两个独立的实验；

(U) 通过流式细胞术随时间测量的氧化磷酸化(任意单位，a.u .)。雄性GF小鼠小胶质细胞δψm的代表性流式细胞术图(左)和重新着色。GF小鼠(右)；

(V) 量化。数据代表了两个独立的实验；

(W) 基于Imaris的代表性Iba1⁺皮质小胶质细胞和Tom m20+GF线粒体三维重建并重新着色。GF雄性小鼠。比例尺，10 μm；

(X,Y) 定量。

随后，我们通过透射电子显微镜(TEM)对小胶质线粒体的数量进行了定量分析(图3G)。超微结构方面，小胶质细胞表现出典型的形态特征，如独特的异染色质模式、小的胞质边缘以及Iba1和PU.1的免疫反应性。根据使用有丝分裂跟踪器和流式细胞术测量的线粒体质量增加量，TEM显示GF小胶质细胞中线粒体数量增加(图3G和3H)。

接下来，我们重新聚焦于更详细地理解δψm(线粒体膜电位)的差异。在鱼藤酮抑制复合物I (C1)之前，我们通过TMRM染色随时间直接测量了δψm，这导致SPF和GF小鼠的小胶质细胞中δψm等效下降(图3I和3J)。加入CII底物琥珀酸盐可以绕过对CI的抑制，恢复电子传递链(ETC)的活性并重建δψm(图3I和3J)。在GF小鼠的小胶质细胞中，琥珀酸驱动的δψm增加明显受损(图3I和3J)。正如预期，抗霉素A1 (AA1)对CIII的抑制作用在两个小胶质细胞群体中均减弱了δψm(图3I和3J)。通过海马分析对离体分离的小胶质细胞和腹腔巨噬细胞独立验证了基于流式细胞术的评估中使用的实验设置。我们发现，在SPF和GF小胶质细胞中，δψm对丙酮酸盐和苹果酸盐(它们为CI提供燃料)的反应相当地增加，表明小胶质细胞CI功能不受微生物群的影响。此外，我们向CIV提供了抗坏血酸和四甲基苯二胺，但未检测到任何改变，表明GF动物的小胶质细胞存在选择性CII损害。这不太可能是由于CII成分的表达不同，因为SDHA(CII的主要成分)在GF和SPF小鼠的小胶质细胞中表达相当(图3K-3M)。

CII活性降低的另一种解释是，来自GF小鼠的小胶质细胞的内源性CII抑制剂水平升高。其中，发现OAA(草酰乙酸)增加(图3N和2C)。我们发现，OAA能够以剂量依赖性方式抑制琥珀酸诱导的SPF小胶质细胞中的CII活性(图3O和3P)，支持OAA能够抑制GF小鼠小胶质细胞中CII活性的可能性。

接下来，我们研究了GF小鼠的出生后再定殖是否足以调节小胶质细胞的特性。因此，GF小鼠在出生后暴露于SPF供体小鼠，并在8周后进行检查。与GF对照组相比，重新定殖的GF小鼠显示小胶质细胞明显减少(图3Q和3R)。此外，线粒体质量和δψm在重新定殖时恢复(图3S和3T)，与GF小鼠的小胶质细胞相比，加入琥珀酸后δψm充分增加(图3U和3V)。基于Imaris的3D重建详细地显示，与GF小鼠相比，重新定殖的GF小鼠的小胶质细胞体积减少(图3W)。值得注意的是，与GF小鼠相比，重新定殖的GF小鼠中小胶质细胞显示出更少的Tomm20⁺线粒体，而线粒体体积保持不变，排除了线粒体融合或分裂改变的作用(图3W-3Y)。此外，我们通过抗生素(ABX)治疗在出生后耗尽了肠道细菌，并发现与SPF对照组相比，在ABX治疗小鼠的小胶质细胞中应用琥珀酸后δψm降低，突出了肠道细菌和小胶质细胞代谢特征之间的动态和可塑性相互作用。

细菌来源的醋酸盐在稳定状态下恢复减少的小胶质细胞适应性

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SCFAs乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐是细菌发酵产物，我们和其他人最近研究表明，它们对于小胶质细胞在稳态和感染期间的成熟和功能至关重要。然而，尚不清楚不同的SCFAs是仅协同作用于小胶质细胞还是单独作用于小胶质细胞。因此，我们通过饮水向GF小鼠单独提供了SCFAs或乙酸盐、丙酸盐或丁酸盐的混合物，为期4周。根据前期工作的预期，SCFAs混合物能够将在GF中发现的升高的小胶质细胞密度降低至在SPF条件下观察到的正常小胶质细胞数量(图4A和4B)。这种效应仅通过醋酸盐而不是丁酸盐或丙酸盐得以重现。通过补充醋酸盐纠正小胶质细胞数量的同时，Ddit4表达减少，而丁酸盐和丙酸盐对Ddit4 mRNA水平无影响(图4C)。小胶质细胞形态的详细分析显示，只有混合的SCFAs或醋酸盐能够逆转小胶质细胞比例的缺陷(图4D和4E)。这些处理未调节小胶质细胞F4/80水平。

图4 | 微生物群来源的醋酸盐可恢复GF小胶质细胞的小胶质细胞特性

Acetate regulates microglial functions during
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(A) 在单独使用SCFA合剂或醋酸盐、丁酸盐或丙酸盐处理的SPF、GF或GF雄性小鼠的皮质中进行代表性 Iba1⁺ 免疫组织化学检测；

(B) 量化。比例尺，50 μm。数据代表三个独立实验；

(C) 定量PCR检测Ddit4 mRNA。基因表达恢复正常，为β-Actin。数据代表了三个独立的实验；

(D) 基于Imaris的代表性Iba1+皮质小胶质细胞的3D重建，这些小胶质细胞来自单独使用SCFA合剂或醋酸盐治疗或未治疗的GF雄性小鼠。比例尺，10 μm；

(E) 量化；

(F) 描述雄性SPF、GF和GF(+醋酸盐)小鼠的分离自FACS的小胶质细胞之间的不同受调控和重叠基因的Venn图；

(G) RNA-seq分析显示，在雄性SPF、GF和GF(+醋酸盐)小鼠的小胶质细胞中，DEGs的调整值p < 0.05。颜色代码显示Z分数(红色，上调；蓝色，下调)。

为了检查醋酸盐对小胶质细胞转录组谱的影响，我们从SPF、GF和醋酸盐处理的GF小鼠中分离了小胶质细胞，并通过RNA-seq分析了全基因组mRNA表达谱(图4F和4G)。一般而言，在这些条件下有856个基因受到调控(图4F)。值得注意的是，来自SPF和GF(+醋酸盐)小鼠的小胶质细胞仅表现出26个独特的DEG(differentially expressed genes)，而来自SPF和GF小鼠的小胶质细胞以及来自GF和GF(+醋酸盐)小鼠的小胶质细胞分别表现出142个和324个独特的DEG(图4F和4G)。在DEG中，我们观察到在GF小胶质细胞中Apoe和Ddit4表达上调。P2ry12显示GF小鼠小胶质细胞表达减少，在醋酸盐存在下恢复(图4G)。DEGs的后续IPA(ingenuity pathway analysis)显示，例如，细胞的NFkB信号和免疫应答恢复。

然后，我们询问是否可以通过SCFAs纠正线粒体代谢缺陷。我们发现，单用SCFAs和醋酸盐的混合物可以使GF小鼠小胶质细胞中的线粒体数量正常化(图5A、5B)。通过3D重建检查小胶质细胞中Tomm20+线粒体的空间维度，证实与SPF小鼠相比，GF小鼠的每个小胶质细胞中有更多的线粒体，但显示线粒体体积和球形度未改变(图5C-5E)。最重要的是，我们发现在GF小鼠中补充醋酸盐足以恢复加入琥珀酸盐后小胶质细胞中的δψm(图5F和5G)。这些发现表明，醋酸盐治疗可以挽救CII相关的小胶质细胞功能障碍。

图5 | 微生物群来源的醋酸盐恢复GF小胶质细胞的代谢功能不全

Acetate regulates microglial functions during
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(A) 皮质小胶质细胞的代表性TEM图像。红色箭头显示细胞质中有线粒体；

(B) 量化；

(C) 基于Imaris的代表性Iba1⁺皮质小胶质细胞和Tomm20⁺线粒体三维重建；

(D,E) 其定量。比例尺，10 μm；

(F) 通过流式细胞术测量氧化磷酸化随时间的变化。来自雄性SPF(左)和GF小鼠(中)以及乙酸盐处理的GF 小鼠(右)的小胶质细胞的δψm的代表性流式细胞术图；

(G) 量化。数据来自三个独立的实验；

(H) 在接受醋酸盐口服处理或未接受醋酸盐治疗4周的雄性SPF和GF小鼠的大脑中，醋酸盐、丁酸盐和丙酸盐的丰度；

(I) 雄性SPF、GF和sDMDMm2小鼠血清中醋酸盐、(异)丁酸盐和丙酸盐的浓度；

(J) 口服给药6小时和12小时后，雄性GF小鼠的脑、结肠、肝和血清中柠檬酸盐的醋酸盐衍生的13C标记碳的分数。数据代表了两个独立的实验；

(K) 用5 mM醋酸盐孵育6 h后，培养的原代神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞从培养基中摄取醋酸盐的百分比。数据代表了两个独立的实验；

(L) 孵育6小时后，原代神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞中柠檬酸盐的醋酸盐衍生的13C标记碳的分数。数据是两个独立实验的典型。

我们的数据表明，来自肠道的乙酸盐能够影响CNS细胞的生物学特性。与此一致，质谱分析允许检测所有实验组小鼠的CNS中的乙酸盐，尽管与SPF小鼠相比GF中的乙酸盐水平显著较低。在GF小鼠中，口服醋酸盐治疗4周后，CNS醋酸盐水平显著升高(图5H)。在不同笼舍小鼠的CNS中检测到的丁酸盐和丙酸盐水平可以忽略不计。为了证明肠道细菌的存在增加了SCFA水平，我们定量测量了sDMDMm2小鼠血清中的SCFA浓度，该小鼠体内有一个由12种选定的产乙酸细菌菌株组成的稳定且定义适度多样的小鼠微生物群。sDMDMm2小鼠的血清中醋酸盐水平与SPF对照组相当，而GF小鼠的醋酸盐丰度显著降低(图5I)。为了在体内特异性追踪肠源性醋酸盐，我们通过口腔喂食向GF小鼠提供了13C-醋酸盐，并在6和12小时后测量了脑、结肠、肝和血清中13C标记碳的掺入量(图5J)。在治疗后6小时，在所有受试器官和血清中的TCA循环的几种代谢产物中测量到乙酸衍生的13C的显著掺入。为考察CNS细胞是否能直接吸收醋酸盐，将原代细胞体外暴露于醋酸盐中(图5K)。神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞均从培养基中获得乙酸盐(图5K)，并将乙酸盐衍生的13C整合到各种代谢产物中，包括TCA循环中间体柠檬酸盐、α-酮戊二酸盐、富马酸盐、苹果酸盐和琥珀酸盐(图5L)，突出了小胶质细胞对乙酸盐的直接摄取和使用。总之，我们的数据表明，小胶质细胞的属性和代谢功能受肠道来源的醋酸盐控制。

在神经变性过程中单独使用醋酸盐可调节小胶质细胞的功能

Acetate regulates microglial functions during
neurodegeneration

小胶质细胞被认为与AD(最常见的神经退行性疾病)的发病机制有关。我们先前在5xFAD小鼠模型中发现共生细菌会损害AD病理学，尽管细菌衍生产物(如SCFAs)是否调节Aβ负荷尚不清楚。为了检测肠道细菌是否通过参与不同细胞因子和代谢基因的基因调节的允许染色质标记来塑造小胶质细胞免疫反应，我们使用了16周龄的雄性5xFAD小鼠。对SPF和GF 5xFAD小鼠小胶质细胞的分析显示，在 促炎基因(如 Cxcl10和Isg15 )的转录起始位点或其周围有较高水平的H3K9ac。与GF 5xFAD小鼠的小胶质细胞相比，参与糖酵解途径的第一个ATP生成步骤的代谢相关基因(如Pgk1(磷酸甘油酸激酶1))在SPF 5xFAD小鼠的小胶质细胞中显示H3K9ac增加，这表明在5xFAD小鼠中SPF小胶质细胞的表达和代谢活性较高。与预期一致，与SPF 5xFAD小鼠相比，GF 5xFAD小鼠在海马区表现出Aβ沉积减少和斑块尺寸变小(如噻嗪红(TR)所示)(图6A、6B)。值得注意的是，分析前通过饮用水向GF 5xFAD小鼠施加醋酸8周后，导致较大TR⁺ Aβ斑块数量增加，与来自SPF 5xFAD小鼠的斑块数量相当(图6A、6B)。GF 5xFAD小鼠中斑块负荷减少伴随着Iba1⁺实质小胶质细胞密度增加(图6C和6D)。对TR⁺斑块相关的Iba1⁺小胶质细胞(距TR⁺斑块不到10微米的细胞)的评估显示，GF 5xFAD小鼠中接近Aβ的细胞明显多于SPF 5xFAD小鼠，而醋酸盐治疗逆转了这一效应(图6E)。

图6 | 醋酸盐增加5xFAD小鼠的海马Aβ沉积

Acetate regulates microglial functions during
neurodegeneration

(A) 噻嗪红(thiazine red)的代表性免疫荧光图像(TR；红色)在用醋酸盐口服处理8周的16周龄雄性SPF、GF和GF 5xFAD小鼠中。细胞核用4，6-二脒基-2-苯基吲哚染色(DAPI；蓝色)。比例尺，300微米(概述)和50微米(插入)；

(B) 每面积TR⁺Aβ斑块数的定量(mm2)；

(C) 含海马组织切片上TR(红色)和Iba1(绿色)的代表性免疫荧光图像。细胞核用DAPI(蓝色)染色。比例尺，50 μm；

(D,E) IBA 1⁺实质(D)和TR⁺斑块相关(E)小胶质细胞的定量；

(F,G) Venn图，描述了与相同条件下的相应非转基因同窝仔相比，雄性5×fad动物的FACS分离的海马小胶质细胞之间的不同受调控和重叠基因(F)，以及5×fad动物之间的(G)；

(H) RNA-seq分析显示，在雄性SPF、GF和GF(+醋酸盐)5xFAD和WT动物的海马小胶质细胞中，deg的调整值p < 0.05。颜色代码显示Z分数(红色，上调；蓝色，下调)。另见表S17；

(I-N) 描绘了与相同住房/治疗条件下的WT同窝仔相比，雄性SPF、GF和GF (+乙酸盐)5xFAD动物的海马小胶质细胞中DEGs上IPA的(I-K)典型途径和(L-N)功能结果。图表描述了log(p)值和预测的活化Z评分(红色，活性增加；蓝色，活性降低；灰色，无预测Z分数可用；N.d .，不可检测)。另见表S18和S19。

为了更详细地研究醋酸盐对小胶质细胞的影响，通过RNA-seq分析了来自SPF、GF和醋酸处理GF小鼠的海马小胶质细胞(图6F-6H)。值得注意的是，与WT对照组相比，来自SPF和GF(+醋酸盐)5xFAD小鼠的小胶质细胞分别显示481和576 DEGs，而来自GF 5xFAD小鼠的小胶质细胞与非转基因动物相比仅显示242 DEGs(图6F和6H)。仅比较来自5xFAD小鼠的小胶质细胞，我们在GF和SPF组的小胶质细胞中检测到452个独特的DEG，而来自GF和GF(+醋酸)的小胶质细胞显示82个独特的DEG，来自GF(+醋酸)和SPF 5xFAD小鼠的小胶质细胞显示23个独特的DEG(图6G)。在DEG中，我们观察到Aβ刺激导致的基因表达增加，如Clec7a、Axl、Apoe、Itgax或Trem2(图6H)。随后的IPA显示，例如，在所有三组中，干扰素信号均上调，但与野生型(WT)动物相比，GF 5xFAD小鼠的小胶质细胞中的上调程度较低(活化Z评分:SPF 5xFAD对WT，2.309；GF 5xFAD对比WT，1.667；GF[+醋酸盐] 5xFAD对比WT，2.496(图6I–6K)。作为对患病CNS的反应，所有三组的小胶质细胞均表现出上调的糖酵解和糖异生途径，由此GF 5xFAD小鼠的小胶质细胞中显著性降低(图6I-6K)。有趣的是，发现TGF-β信号仅在来自GF 5xFAD小鼠的小胶质细胞中上调，相反，在GF 5xFAD组中功能注释细胞因子的量、细胞的活化、炎性反应和吞噬细胞的趋化性降低，并通过补充乙酸恢复(图6I-6N)。相反，IPA预测GF 5xFAD小鼠小胶质细胞中ROS合成上调(图6L-6N)。

如上所述，在稳态条件下，GF小鼠的小胶质细胞显示出CII功能缺陷(图3I和3J)。相反，如甲氧基-O4 (methoxy-O4，MXO4)掺入所示，αβ-吞噬小胶质细胞在琥珀酸应用时δψm的升高没有显示出差异，表明在5xFAD模型中CII似乎不受肠道细菌的影响。此外，我们还分析了SPF和GF 5xFAD小鼠的MXO4和MXO4+小胶质细胞的葡萄糖摄取量。与RNA-seq数据(图6I-6K)和ChIP数据一致，我们发现GF 5xFAD小鼠小胶质细胞的葡萄糖摄取减少，进一步支持糖酵解受损。

接下来，我们分析了来自SPF、GF和乙酸盐处理的GF 5xFAD小鼠的TR⁺斑块相关小胶质细胞的形态(图7A、7B)。值得注意的是，与来自SPF和GF(+乙酸)5xFAD小鼠的小胶质细胞相比，来自GF 5xFAD小鼠的小胶质细胞分支更多。此外，与SPF 5xFAD小鼠相比，我们观察到GF 5xFAD小鼠斑块相关小胶质细胞中的Tomm20⁺线粒体数量更高(图7A和7C)。向GF 5xFAD小鼠补充醋酸盐恢复了斑块相关小胶质细胞中的小胶质细胞形态和线粒体数量(图7A-7C)，而线粒体体积和球形的平均值和百分位数未受影响。

图7 | 神经变性过程中醋酸盐对小胶质细胞功能的调节

Acetate regulates microglial functions during
neurodegeneration

(A) 基于Imaris的代表性Iba1⁺ TR+斑块相关小胶质细胞和Tomm20⁺线粒体三维重建。比例尺，6 μm；

(B,C) 量化；

(D) 门控来自雄性SPF、GF和乙酸盐处理的GF 5xFAD小鼠及年龄匹配的WT对照的甲氧基-O4⁺ (MXO4)小胶质细胞。显示了特征点图；

(E) 来自雄性SPF(黑线)、GF(红线)和乙酸盐处理的GF(蓝线)WT小鼠以及SPF(黑虚线)、GF(红虚线)和乙酸盐处理的GF(蓝虚线)5xFAD小鼠的MXO4⁺小胶质细胞的代表性细胞计数图；

(F) 描述了MFI的定量和MXO4⁺小胶质细胞的百分比。数据代表了两个独立的实验；

(G) 小胶质细胞线粒体ROS的典型细胞计数图；

(H) 描述了MFI的定量和MitoSox阳性标记细胞的百分比。数据代表了两个独立的实验；

(I) 单体淀粉样β蛋白(Aβ，红色)处理6小时后培养的Iba1⁺原代小胶质细胞的代表性免疫荧光图像(绿色)。细胞核用DAPI染色(蓝色)。比例尺，50 μm；

(J) 使用或不使用5 mM醋酸盐治疗6 h后，Iba1⁺ Aβ⁺小胶质细胞的百分比。每个符号代表一个生物复制品。数据代表了两个独立的实验；

(K) Cxcl10、Ccl5和RelB mRNA，通过qPCR在培养的原代小胶质细胞中测定，这些小胶质细胞在单独使用醋酸盐或单体Aβ或与醋酸盐和单体aβ联合使用6 h后受到攻击或未受到攻击。基因表达被标准化为β-Actin。每个符号代表一个生物复制品。数据代表了两个独立的实验；

(L) 在有或没有单体Aβ的情况下，培养6小时后原代小胶质细胞从培养基中摄取醋酸的百分比。每个符号代表一个生物复制品。数据代表了两个独立的实验；

(M) 有或无单体Aβ孵育6小时后，原发性小胶质细胞中各种代谢产物的乙酸酯衍生13C标记碳的分数。数据代表了两个独立的实验。

有人提出，与非病理学相关的小胶质细胞相比，斑块相关的小胶质细胞通过改善迁移和增加吞噬作用，在限制AD中老年斑块形成方面发挥关键作用。因此，我们研究了Aβ的小胶质细胞摄取是否受醋酸盐的影响。如最近所述，我们观察到在GF条件下MXO4⁺小胶质细胞百分比较高(图7D-7F)。值得注意的是，补充醋酸盐使MXO4⁺小胶质细胞的百分比恢复至SPF水平(图7D-7F)，表明Aβ的小胶质细胞吞噬作用被醋酸盐改变。

为了检查在神经变性期间醋酸盐是否也能够塑造小胶质细胞代谢，我们分析了小胶质细胞线粒体ROS的产生。有趣的是，来自5xFAD小鼠的MitoSox⁺ MXO4⁺小胶质细胞百分比升高，如果细胞来自GF 5xFAD小鼠，这种情况会进一步显著增强(图7G和7H)。对GF 5xFAD小鼠进行醋酸盐处理，使MXO4⁺有丝分裂Sox⁺小胶质细胞的百分比正常化至在SPF 5xFAD小鼠的小胶质细胞中观察到的水平(图7G和7H)，这与RNA-seq数据一致，据此我们观察到ROS合成途径的激活(图6L和6M)。与MXO4^–小胶质细胞相比，MXO4⁺小胶质细胞显示δψm和CellRox信号增加，但这些参数仅显示了醋酸盐的轻微调节作用。

为了检查Aβ的存在是否改变小胶质细胞对乙酸的摄取，在体外将原代小胶质细胞暴露于含和不含乙酸的Aβ(图7I)。以前的报告显示，促炎细胞因子表达增加会损害小胶质细胞对Aβ的摄取。直线上，存在醋酸盐时，Iba1+ Aβ+小胶质细胞的百分比显著降低(图7J)，当醋酸盐和Aβ联合应用时，Cxcl10、Ccl5和Relb的基因表达上调(图7K)。值得注意的是，在存在Aβ的情况下，小胶质细胞从培养基中获得了更多的醋酸盐(图7L)，并在包括TCA循环中间产物在内的各种代谢产物中掺入了略多的醋酸盐衍生的13C(图7M)，这表明醋酸盐至少部分地推动了TCA循环。

总之，这些数据表明，在AD的5xFAD小鼠模型中，肠源性醋酸盐可调节小胶质细胞的功能。

讨论

在此，我们描述了肠-脑相互作用的新方面，即SCFA醋酸盐调节生理性小胶质细胞功能，并且还能够通过塑造小胶质细胞先天免疫机制来改变AD病理。我们进一步确定宿主微生物群是小胶质细胞线粒体功能的重要诱导剂。我们发现，肠道微生物群的缺乏导致体内稳态下ETC CII病的明确功能损害，这与线粒体功能的其他扰动相关。这些线粒体缺陷是通过醋酸盐纠正的，这些细胞能够利用醋酸盐为TCA循环提供燃料。

众所周知，在健康和患病的CNS中，宿主共栖是维持小胶质细胞成熟和功能所必需的。已记录了肠道微生物群对中风、AD、PD、肌萎缩性脊髓侧索硬化等多种病理以及多发性硬化小鼠模型中的CNS疾病的影响。已有来自人类的可比数据证实了来自小鼠的这些发现的相关性。

在此，我们表明未成熟小胶质细胞表型是通过改变的H3K4me3和H3K9ac表观遗传印记的，它们可能调节小胶质细胞的特性，包括细胞代谢。实际上，我们确定了原位小胶质细胞代谢状态基本上受共生微生物存在的调节。迄今为止，对小胶质细胞体内代谢状态的研究很少，大多数现有数据来自培养的小胶质细胞，或来自造血干细胞衍生的骨髓巨噬细胞，它们代表不同的发育谱系，因此不等同于小胶质细胞。通过优化实验方案，我们能够确定从GF小鼠分离的小胶质细胞中的几种代谢缺陷，例如线粒体数量增加伴δψm降低。我们认为GF小鼠小胶质细胞线粒体与SPF小鼠小胶质细胞线粒体的差异反映了线粒体呼吸链内CII功能减弱。

已知SCFAs能够从肠转运至体循环并穿过血脑屏障。据报道，它们对免疫细胞(包括Treg细胞或T效应细胞和巨噬细胞)有各种影响。在我们的研究中，醋酸盐在SPF小鼠的大脑中是最丰富的SCFA，在GF小鼠的大脑中被显著减少。之前已在大鼠中描述了醋酸盐在CNS内的蓄积。我们发现，源自肠道的13C-乙酸盐可到达大脑，并可被小胶质细胞和其他CNS细胞代谢，从而恢复观察到的与GF相关的CII功能缺陷。尽管在小胶质细胞的核心代谢中明显引入了醋酸盐，但我们不能排除醋酸盐对蛋白质或组蛋白乙酰化的额外影响，如T细胞所示。此外，在TCA循环、柠檬酸盐生成和ATP生成中，作为碳供体的线粒体中存在乙酰辅酶A (Ac-CoA)形式的醋酸盐。根据需要，柠檬酸盐可以通过柠檬酸盐转运体SLC25A1离开线粒体，并在ATP-柠檬酸盐裂解酶(ACL)的介导下分解代谢为Ac-CoA和OAA，最后Ac-CoA可以促进核组蛋白和细胞质蛋白的乙酰化。在当前研究中，研究显示GF小鼠脑中乙酸盐水平显著降低，这与CII介导的小胶质细胞缺乏有关，可能是由于OAA浓度升高所致。一种可能的解释是，GF小鼠中的小胶质细胞需要醋酸盐(例如，用于蛋白质合成和组蛋白乙酰化)，激活ACL介导的柠檬酸盐向Ac-CoA的转化，但代价是产生OAA，这部分抑制了CII作为竞争性抑制剂的活性，对CII的二羧酸盐结合位点具有高亲和力。实际上，从GF衍生小胶质细胞的靶向代谢组学分析来看，与SPF对照相比，柠檬酸盐显示出强烈的减弱趋势(尽管不显著)，伴有OAA富集。需要未来的研究来解决这个问题，并确切阐明醋酸盐如何影响小胶质细胞生物学。

在AD疾病模型中，我们注意到Aβ病理可受宿主微生物群调节，这与早期报告一致。值得注意的是，单独口服醋酸盐能够通过将小胶质细胞吞噬率调节至在SPF 5xFAD小鼠的小胶质细胞中观察到的水平，从而改变GF 5xFAD小鼠海马区的Aβ负荷。在使用GF 5xFAD小鼠进行的其他研究中，我们排除了淀粉样前体蛋白(APP)加工在CNS中受到缺失注释影响的可能性。尽管我们观察到醋酸盐会影响GF动物小胶质细胞的代谢特征并促进其成熟，但在稳态下，醋酸盐会抑制细胞吞噬作用，最终导致5xFAD动物的Aβ负荷增加。与此同时，醋酸盐诱导小胶质细胞的促炎表型，细胞因子表达升高，这反过来又被描述为削弱小胶质细胞的吞噬作用。值得注意的是，在来自5xFAD小鼠的新分离的吞噬Aβ的小胶质细胞中，我们观察到了代谢变化，线粒体和总ROS以及氧化磷酸化和δψm升高。此外，我们没有检测到在健康条件下在饲养GF的动物中观察到的CII功能障碍。我们推测，在活化的小胶质细胞中，内源性CII抑制剂OAA可能不太丰富，因为OAA可能用于产生葡萄糖和其他代谢产物。相比之下，我们在SPF 5xFAD小鼠的Aβ吞噬小胶质细胞中观察到，与GF 5xFAD对照相比，葡萄糖摄取增加，这表明作为ATP生成主要来源的糖酵解在GF 5xFAD的吞噬小胶质细胞中可能被减弱，导致不太明显的促炎表型。在另一项研究中，据报告SCFAs混合物能够在PD小鼠模型中调节α突触核蛋白病理学，并提示这种效应可能由小胶质细胞通过分泌促炎细胞因子(如IL6和TNF)介导。因此，未来在神经变性过程中对SCFAs的治疗发明应着眼于降低醋酸盐水平，以改善神经变性过程。由于我们将研究重点放在疾病的早期状态，因此向较老的GF 5xFAD补充醋酸盐是否也会影响记忆功能仍有待证明。此外，目前尚不清楚更成熟的小胶质细胞是否也有更好的能力来处理任何类型的感染，这对于保持大脑的相对免疫特权至关重要。因此，有必要在未来进行实验，以阐明醋酸盐在健康和扰动期间对CNS免疫系统的复杂作用。

局限

在此，我们描述了小胶质细胞的乙酸依赖代谢状态，通过使用啮齿动物模型生成了我们的数据。未来的研究有必要解决这些在人类受试者中的发现。事实上，即使第一批报告已经描述了AD中的人类微生物群改变，但仍需对这种微生物群改变进行分析，重点关注醋酸盐和小胶质细胞。此外，此处对小胶质细胞代谢功能的描述可能有限，应采用更深入的方法来解剖小胶质细胞如何整合到生物体的全局代谢调节中。

编译：吴季秋科克大学(UCC)

审核：刘永鑫中科院遗传发育所

Reference

Daniel Erny, Nikolaos Dokalis, Charlotte Mezo, Angela Castoldi, Omar Mossad, Ori Staszewski,Maximilian Frosch,Matteo Villa,Vidmante Fuchs,Arun Mayer,Jana Neuber,Janika Sosat,Stefan Tholen,Oliver Schilling,Andreas Vlachos, Thomas Blank,Mercedes Gomez de Aguero,Andrew J. Macpherson,Edward J. Pearce,Marco Prinz.Marco Prinz. Cell Metabolism, 2021, 2260–2276. https://doi.org/10.1016/j.cmet.2021.10.010

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